pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文

pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文

　　应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白，参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程。pmCherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。2015年9～11月，本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pmCherry-C1载体，构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，旨在为深入研究Argonaute1蛋白的细胞生物学功能提供便利工具。

　　1材料与方法

　　1.1材料质粒、菌株及细胞:pmCherry-C1载体由JohanPerane博士馈赠，感受态大肠杆菌Trans1购自天津科仪嘉欣科技有限公司，HeLa细胞来自本实验室。酶类及主要生化试剂:限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA连接酶均购自ThermoFisherScientific公司，Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司，T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，LumiGLo化学发光底物购于KPL公司。抗体:兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST公司，鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1α抗体购自abcam公司，鼠抗人樱桃红蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL公司，蓝色荧光(AlexaFluor350)标记的驴抗鼠荧光二抗和绿色荧光(AlexaFluor488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔IgG二抗购自KPL公司。引物合成及基因测序由北京天一辉远公司完成。

　　1.2pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒构建

　　1.2.1Argonaute1蛋白目的片段获取提取HeLa细胞的总RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列进行Argonaute1的cDNA扩增;根据CDS序列(NM012199.2)设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反转录的Argonaute1cDNA为模板，扩增PCR目的片段，条件为95℃预变性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15个循环，每次循环降低1℃，再以50℃进行20个循环，72℃延伸10min;将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，并将目的片段与pEASY-T1(T/A载体)于25℃连接15min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，置于含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。

　　1.2.2线性pmCherry-C1质粒载体获取以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1质粒，进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，完整切下呈线性的pmCherry-C1质粒载体，以1%琼脂糖电泳分离，再以凝胶回收试剂盒回收pmCherry-C1线性载体(约4700bp)。在T4DNA连接酶作用下，将线性pmCherry-C1质粒载体与具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下连接并过夜。连接产物转化感受态细菌大肠杆菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。

　　1.3pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒鉴定

　　1.3.1酶切及基因测序采用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1进行单、双酶切鉴定，并以1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小;同时对重组质粒进行基因测序鉴定。

　　1.3.2融合蛋白检测采用Westernblotting法。以预冷的1×NP-40裂解液裂解细胞，超声破碎细胞后4℃、12000r/min离心10min，取上清获取全细胞裂解液，以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、2.5%β-巯基乙醇)，99℃热变性10min，8%SDS-PAGE电泳;以半干转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭3h;加入兔抗人Argonaute1单克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育过夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG二抗室温孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化学发光底物后暗室曝光。

　　1.3.3三色荧光共定位分析以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。将细胞接种于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞达80%融合时，进行脂质体瞬时转染pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒。转染后48h给予0.5mmol/L亚砷酸盐处理1h，以4%多聚甲醛室温固定10min，以高压过的PBS缓冲液洗涤2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室温静置通透10min;加入1%BSA封闭1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育过夜;PBS洗涤3次，10min/次;加入蓝色荧光标记驴抗鼠(1∶800)与绿色荧光标记驴抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育过夜;PBS洗涤3次，10min/次。以不含DAPI的细胞荧光封片液封片并过夜，以激光共聚焦显微镜观察细胞内红、绿、蓝三色荧光信号。

　　2结果

　　2.1Argonaute1目的片段PCR扩增目的片段长度约为2574bp。

　　2.2线性pmCherry-C1质粒载体完整的线性pm-Cherry-C1质粒载体经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后，在4722bp左右出现条带，纯化回收后用于后续的连接反应。

　　2.3重组真核表达质粒pmCherry-C1-Argonaute1鉴定结果

　　2.3.1酶切及基因测序将构建的重组质粒分别进行EcoRⅠ和BamHⅠ的单、双酶切，产生的条带大小与预期相符，重组质粒基因测序结果正确，证明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位点上。

　　2.3.2融合蛋白表达Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量为89.7KDa，Westernblotting法检测的蛋白条带与目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表达成功。

　　2.3.3三色荧光共定位转染构建的重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在细胞内发现荧光信号，当细胞受到氧化应激时Cherry-Argonaute1可在胞质内形成红色的颗粒状结构，与SGs的标志蛋白G3BP(蓝色)、PBs的标志蛋白DCP1α(绿色)颗粒结构均呈共定位关系。

　　3讨论

　　Argonaute1蛋白家族是一类相对分子量约为100KDa的序列保守蛋白，表达于人、果蝇、拟南芥等多个物种。Argonaute1蛋白家族包括多个成员，多含有月牙状的PAZ和具有潜在核酸内切酶活性的PIWI结构域，参与miRNA、siRNA、piRNA等多个非编码小RNA的细胞生物学过程。研究发现，Argonaute1是RNA诱导沉默复合体的核心元件，与siRNA生成、靶mRNA降解、细胞应激等过程密切相关。生物体的生存环境复杂多变，机体细胞为应对氧化应激、渗透压休克、热休克、紫外线辐射和病毒感染等多种外界刺激而建立相应的“应激反应体系”，以保持细胞旺盛的生命力。转录后基因调控机制是其中至关重要的环节，它可调控胞质内RNA代谢、暂时抑制应激细胞中蛋白的翻译过程、节省细胞内合成代谢的原料和能量、优先表达应激所特需的蛋白等。SGs和PBs是细胞受到应激时在胞质内形成的与RNA代谢密切相关的颗粒状结构。这两种颗粒结构实质上是一系列蛋白、核酸的聚集体。随着研究的深入，不断有新的应激蛋白被发现。

　　其中，Argonaute1蛋白同时参与细胞中SGs和PBs的形成。通过基因工程的方法对Argonaute1蛋白进行荧光蛋白标记，可用于探讨Argonaute1蛋白在细胞应激中的作用。Cherry是四聚体Discosomasp.红色荧光蛋白的一个突变体，荧光强度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1载体允许目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成红色荧光标记的目的蛋白。本研究通过构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的方法对Argonaute1蛋白进行Cherry的荧光标记。在Westernblotting实验中发现，利用抗内源性Argonaute1抗体可以检测出两个条带，而抗Cherry抗体检测出一个条带，表明pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒能够在活细胞内成功表达Cherry与Argonaute1的融合蛋白。当细胞受到亚砷酸盐氧化应激刺激时，Cherry标记的Argonaute1蛋白可与应激颗粒(以G3BP蛋白为标记蛋白)和加工体(以DCP1α为标记蛋白)均呈共定位关系，说明Argonaute1蛋白为细胞应激和加工体的共同成员。

　　总之，本研究成功构建了重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒，其可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白;上述结果有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病研究领域的生物学作用机制。

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