器官模拟物的三维培养技术解析论文

器官模拟物的三维培养技术解析论文

　　【提要】 类器官是成熟器官来源的三维上皮结构，包含干细胞或祖细胞，能够独立扩增并且分化为器官特异性上皮。利用三维方法培养类器官技术在组织再生、研究机体生理病理学、构建疾病模型及药物筛选等方面均有广阔的前景应用。本文将就三维条件下类器官培养的基础、应用和前景作一简要综述。

　　【关键词】 类器官； 三维培养； 再生医学； 综述。

　　类器官是指在结构和功能上都类似来源器官或组织的模拟物，其为成熟器官来源的三维上皮结构，包含干细胞或祖细胞，能够独立扩增并且分化为器官特异性上皮。Lancaster 等[1]认为类器官是源于多能干细胞或器官祖细胞且具有胚层特异性的类器官体，其包含目标器官中至少一种细胞类型，能够自组装为器官样结构并具有其生理结构和功能特征。通过 3D 培养技术在体外利用干细胞或类器官模拟人类器官组织的生理发育过程和诱导致病，并应用于生物医药和再生医学，已成为目前组织工程和再生医学领域的新热点。本文就类器官培养的基础、应用和前景做一综述。

　　1 类器官技术简介

　　1. 1 类器官形成的基础

　　自组装是类器官形成的关键，其是指在无外力干预的条件下，干细胞或多细胞依靠各组分间的相互作用自我分化为多种结构的过程，例如在唾液腺上皮细胞的三维培养中可见自发形成的分支样或者芽状结构[2].这一过程的自发形成依赖于生理性的内源机制，并由细胞与基质间以及细胞与细胞间的多种细胞因子及信号通路共同参与。但这一内源机制并非固定不变，时间、空间的变化均可增加其复杂性和多样性。在类器官形成过程中，关于自组装的相关调控机制等问题，仍需要进一步深入研究。

　　1. 2 生物工程辅助技术类器官

　　类器官自组装的实现很大程度上依赖于三维细胞培养体系的建立。根据是否为细胞提供支架材料，三维培养体系大体可分为基于支架的培养体系和无支架的培养体系，而支架又分为天然形成和人工合成支架。研究者们发现，生物支架是组织再生的关键因素，多种组织细胞可以在生物材料上生长、分化并最终形成人工组织或器官[3]

　　.生物支架对组织再生的这一作用与支架的组成成分、空间结构、机械及化学特性、释放生物化学信号及分子信号等性质密不可分。而组织特异性细胞外基质（ extracellular matrix,ECM） 在上述作用方面有独特优势。有学者通过诱导胚胎干细胞获得胰腺祖细胞系，将后者与不同发育时期的胰腺间充质（ 间质组织、间叶组织） 共培养，发现与器官类型匹配的间充质可以使祖细胞扩增一百万倍以上，并且在扩增、自我更新的同时保持不分化状态，但同时仍保留其分化能力，因此，该学者认为 ECM 能够传递阶段特异性和组织特异性的再生信号[4],但具体机制尚需要进一步的研究。器官存在的微环境还通过随时间和空间而变化的生物化学信号影响器官再生，所以需要在这方面进一步发展生物工程辅助技术[5].目前，有学者在仿生的聚乙二醇水凝胶上合成了一种特殊蛋白质，而且其蛋白梯度可以人工控制，因而实现分子信号和化学信号在时间和空间上更为精确的释放； 但这种蛋白梯度是静态的，且只局限于凝胶表面的二维体系[5].2014 年，加拿大多伦多大学的研究员报道了一种新型数字化微流体平台，该平台可在水凝胶材料中培养细胞，然后用电场操纵细胞，使得每个凝胶均可单独访问，动态流体交换更加温和，成本明显减少，并且可实现信号分子的三维调控； 此外，该研究员提出或许可以收集患者的小组织样本并将其分布到数字微流体装置的 3D 凝胶中，进行筛选药物以确定个性医疗方案，而这将是实现精准医疗理念的重要工具[6]

　　2 类器官的应用

　　2. 1 肠类器官 HansClever

　　课题组证实单一的 Lgr5+干细胞能够在体外持续增殖并自组装形成隐窝 - 绒毛样的小肠上皮结构[7].进一步的研究结果显示，单个成人 Lgr5+干细胞也能在体外成功扩增成结肠类器官，将这种功能性的结肠上皮移植到硫酸葡聚糖诱导的急性结肠炎小鼠模型中可以修复其受损的结肠上皮[8].这提示利用单一成人结肠干细胞体外扩增进行结肠干细胞治疗是可行的[8].有学者还应用人诱导型多能干细胞（ induced pluripotent stem cells,iPSCs） 直接定向分化为小肠组织的方法明确了 Wnt3a 蛋白和成纤维细胞生长因子 4 是后肠特定分化所必需的物质，而且，这种iPSCs体外构建的人体肠道组织中存在的小肠干细胞，也具有小肠特有的吸收和分泌功能[9].这有助于未来人肠道疾病药物的设计研究，可大大提高了药物利用率。目前，已有学者构建了小鼠小肠 3D 类器官来进行 P-糖蛋白抑制剂的筛选，为 P-糖蛋白介导的药物转运研究提供了强有力的工具[10].

　　2. 2 肝类器官

　　2013 年，Takebe 等[11]将人多能干细胞来源的肝细胞、人间充质干细胞和人内皮细胞混合后在基质胶中培养，发现 3 种细胞自组装成 3D 化肝芽，将该肝芽移植到丙氧鸟苷诱导肝脏衰亡的 TKNOG 小鼠体内后发现这种肝芽可以连接小鼠肠系膜血管，小鼠也出现了人类特有的药物代谢过程。这为肝脏器官发生的研究提供了有益尝试。大型哺乳动物的类器官再造工程也许能加速人类器官移植治疗和疾病致病机制研究的进展。2015 年，Nantasanti 等[12]利用狗的肝脏干细胞构建了可分化为功能性肝细胞的肝类器官模型，能用于铜潴留症的治疗。猫被认为是非常适用于研究人类代谢性疾病的模型，所以利用猫的胆道组织构建肝类器官，可能是原发性肝胆疾病研究及药物筛选的有益工具，但至今也未见利用猫建立长期保持基因稳定的肝脏干/祖细胞培养体系的报道[13].

　　2. 3 胰腺类器官

　　有学者发现，当控制骨形态发生蛋白 4、碱性成纤维细胞生长因子、激活素 A 和 Wnt3a 的表达水平或使用一些小分子化合物进行干预时，可以控制内胚层细胞向特定的方向分化，最终形成胰腺[14].目前，构建胰岛类器官的主要方法包括利用各种干祖细胞产生胰岛样细胞群和利用各种来源的胰腺细胞悬液或胰腺组织块自组装成拟胰岛体[15].2011 年，Saito 等[16]将人 iPSCs 和胚胎小鼠胰岛细胞体外共培养，最后形成能够产生胰岛素的不成熟细胞群，该细胞群由胰岛 α 细胞包绕中央的 β 细胞构成，这种结构和成年鼠胰岛相似，将其移植到链脲菌素诱导的高血糖小鼠模型中后发现小鼠血糖水平得到极大改善。而进一步的体内实验研究还需要关注如何规避免疫反应、促进再血管化、促进类器官分化发育等问题，在这方面，Sabek 等[17]提出制备纳米腺体来促进胰岛发挥作用，这种纳米腺体是运用 3D 打印技术制作可吸收聚合物胶囊包裹胰岛样细胞团形成的，这可能是未来胰岛类器官应用的一种思路。

　　2. 4 脑类器官

　　近来，谱系重编程技术为获取特异性种子细胞提供了新的途径。Lancaster 等[18]通过加入不同生长因子的方法将人类胚胎干细胞（ embryonic stemcell,ESC） 和 iPSC 在神经培养基 3D 培养出了与 9 ~ 10周胚胎大脑类似的“类大脑”,此类迷你大脑具备人类大脑发育初期的一些主要区域，也出现了背侧皮层、腹侧前脑等可辨认的特征，但由于缺乏一些特定的特征，如小脑、海马状突起等，这些区域无法应用于干细胞模型。之后，该研究者利用小颅畸形患者的皮肤成纤维细胞诱导形成了患者特异性 iPSC 细胞系，并应用后者构建了小颅畸形脑类器官模型，通过对照实验发现，正常 ESC和该 iPSCs 在类器官形成上并没有明显差异，但是后者形成的类器官中有大量未成熟的神经元分化[18],这为大脑发育紊乱类疾病的`研究提供了一定的思路。2015年 Kirwan 等[19]应用人 iPSC 体外构建了人大脑皮层神经网络，能够模拟人体内皮层网络的发育和功能，这表明可以在体外通过构建大脑类器官来进行人类前脑神经网络生理学机制的研究。

　　2. 5 前列腺类器官

　　2014 年，研究人员首次在实验室利用来自转移性前列腺癌患者的活检标本和去势抵抗性前列腺癌（ castration-resistant prostate cancer,CRPC） 患者的循环肿瘤细胞成功培育出 7 个前列腺癌类器官，这些前列腺癌类器官以及从中获得的肿瘤移植物的组织结构及基因突变谱与患者转移灶样本高度相似[20]。 Nicholson 等[21]也应用类器官培养技术成功在体外构建患者来源的异种移植物模型，相比于人源性肿瘤组织异种移植及基因工程鼠模型，这种新型的患者来源的类器官能更好地代表 CRPC 等高级别前列腺癌，还能代表前列腺癌的庞大临床疾病谱，而这种疾病谱是目前仅有的前列腺癌细胞系无法代表的，因而在前列腺癌药物筛选和个体化治疗中展现出巨大的应用前景。

　　3 展 望

　　类器官不仅是研究组织及器官发生、发展的有效工具，还能用于药物疗效和药物毒理学性质的检测，更重要的是可以利用患者来源的干细胞深入研究疾病的发生机制、进行细胞及基因治疗，这使得类器官有望成为今后的研究热点。

　　3. 1 人体芯片

　　人体芯片或器官芯片与类器官的构建原理相似，是类器官在药物毒理及代谢方面的另一种应。用形式。器官芯片是将活的人体器官细胞植入到高度模拟人体微环境的芯片上制备而成。单个器官芯片的制作技术添加了多孔型隔膜和营养液，使芯片能模仿人类的血液流动和细胞生长。目前已研制成功的器官芯片有“肺”、“肝”、“肾”和“肠”.2010 年，模拟人肺泡和毛细血管间作用的仿生生物系统构建成功，这一人体肺器官芯片揭示机械应力在尘肺发病中的促进作用[22].2013 年，有学者利用人类近端肾小管制备器官芯片来评估顺铂的肾毒性[23].2016 年，可替代的人工肾脏芯片被成功研发，将其植入肾病患者体内后能使患者无需透析治疗，临床实验前的各期人体实验有望在 2017 年底启动。近期，在美国波士顿召开的 2016 年器官芯片移动大会首次展出了人体内脏芯片系统，这一系统连接了7 个主要的器官芯片，高度模拟人体生理机能。不可否认，器官芯片能高度模拟人体状态，从而在制药领域展现出了巨大应用前景，很有可能替代动物实验，大大减少药物研制的成本和进行临床前人体实验的时间，同时能更加了解新药的毒性作用和人体对药物的代谢反应。但是也有学者提出，器官芯片只能植入单一类型的器官细胞，而人们利用动物进行药物测试的一大原因是可以观察到药物对整个生命系统的作用，包括内分泌系统和免疫系统，各种器官之间的相互作用也是其中一个重要观察内容，因而是否能够利用器官芯片组合成人体芯片进行实验将是未来的一个值得研究的内容[24].因此，这种新型实验芯片能否真正取代动物实验，还有待验证。

　　3. 2 临床治疗

　　在利用自体干祖细胞构建生物人工器官并应用于移植治疗方面，类器官具有巨大潜力。此外，利用正常人体和患者来源的组织培养获得的类器官能够用于相应组织的生理学和病理学研究，正常肾脏类器官培养可能有助于明确 Wnt 信号通路的作用，众所周知这一信号通路在肾脏生理性发育中发挥重要作用，但其具体作用机制却并不明确[25 -26].目前，最新的研究是利用确诊某种疾病患者的组织细胞分化培养为类器官，并进行药物筛选以实现精准医疗[27].已经有学者用大肠癌患者的肿瘤细胞分化形成的类器官建立了一个类器官生物银行，利用类器官来检测人体对药物的敏感性和耐药性，从而将患者的肿瘤类型和药物进行配对，最大限度地发挥药物效用并减少不良反应[28].

　　4 缺点及发展瓶颈

　　目前，虽然类器官在体外实验中表现出自我更新和分化的能力，但是传代次数有限，如何提高其传代能力并确保在患者体内也能保持增殖和未分化状态是一个重大挑战[29].另外，体外培养组织一直存在无法再现生物体内血管网络从而造成营养代谢障碍的问题，如果再生医学的研究者试图在大型动物上利用类器官培养得到可用于人体器官移植的替代物，那么就需要进一步研究实现血管化的方法。最后，虽然精准医疗中类器官能够模拟肿瘤的关键成分，但是还是有一些重要元素是类器官无法包含的。如何提高其成熟度，使目前低级的类器官向更高级转化，从而更加接近致病状态，如免疫系统的引进，将是未来研究的一个方向。

　　参 考 文 献

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