自噬的分子标志物研究论文
在生理状态下, 细胞通过自噬 (autophagy) 清除衰老细胞器和突变蛋白, 以维持自身结构稳定和功能正常。自噬还参与胚胎发育、免疫调节等生理过程。病理状态下细胞自噬水平显著升高, 以耐受缺血、饥饿和凋亡等情况。此外, 自噬功能的障碍还会导致某些疾病的发生。根据细胞内底物运送到溶酶体腔的方式不同, 自噬可分为大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 还有些选择性自噬如线粒体自噬 (mitophagy)、聚集体自噬 (aggrephagy)等。不同类型的自噬其发生过程不同,参与的蛋白分子也不同。检测不同自噬过程中的分子标志物的水平、状态与定位有助于评价细胞的自噬水平。
1 大自噬标志物
大自噬的囊泡膜结构起源于内质网和高尔基体等。这些膜片段形成杯状结构, 包裹胞内物质并最终形成闭合的双层膜的囊泡即自噬体, 然后自噬体与溶酶体融合, 自噬体内蛋白质或细胞器在溶酶体中被溶酶体酶降解。因此该过程的标志物包括自噬体囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物和自噬底物标志物三类。
1.1 自噬体标志物
自噬相关蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一类自噬组成蛋白, 参与调节自噬起始和延伸等过程。其中几个关键蛋白, 也成为自噬标志物。
1.1.1 Atg12-Atg5 复合物Atg12 与Atg5 会形成复合物, 甚至在一些哺乳动物细胞中似乎所有Atg5和Atg12都表现为结合体的形式。Atg12-Atg5 复合物在自噬的形成中至关重要。此外, Atg12-Atg5 复合物还可以充当Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 结合系统的E3 样连接酶。Atg12-Atg5 的缺失会导致自噬缺陷。但在短时饥饿状态, Atg12-Atg5 的水平改变并不明显。Atg12-Atg5 复合物的水平检测可采用蛋白质印迹技术 (Western blot) 方法进行。Atg12 分子质量预期为15 kDa, 但在SDS-PAGE 胶上目测大约在19 kDa的位置上。Atg5 分子质量大约为32 kDa。由于Atg12分子质量小, 不易检测, 并且Atg5 与Atg12 的结合是非可逆的, 因此可分别用Atg5 和Atg12 的抗体孵育,然后直接检测Atg12-Atg5 的结合形式, 其分子质量大约在55 kDa 左右。
1.1.2 自噬相关16 样蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 与Atg12-Atg5 复合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物 , 附着在自噬体表面, 在自噬前体膜的延伸中发挥作用。在自噬前体膜完全融合形成封闭的自噬体后, Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物被释放到胞质中。在细胞膜转移作为自噬膜供体的过程中, Atg16L1 可作为一个指标, 其定位在自噬体上,但在完整的自噬溶酶体膜上尚未见分布。因此,Atg16L1 可以用来检测早期自噬体的形成。可对Atg5、Atg12 或Atg16L1 进行免疫透射电镜和免疫染色的检测。检测内源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的点状聚集或斑块可监测自噬的改变。在生理情况下, 内源性蛋白主要是在胞浆中弥散分布的; 而在饥饿等环境应激下自噬被诱导, 则细胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的点状聚集或斑块会明显增加。
1.1.3 Atg8/微管相关蛋白1 轻链3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最广泛使用的分子标志物。在酵母中, Atg8 与PE 偶联形成Atg8-PE[5]。LC3 参与了自噬体膜的形成, 包括两种可相互转化的形式即LC3-I 和LC3-II。细胞内新合成的LC3 经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE 结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是自噬体的标志分子, 随自噬体膜的增多而增加。SDS-PAGE 电泳中, LC3-I 的表观分子质量为18 kDa, LC3-II 的表观分子质量为16 kDa。尽管PE偶联形式的LC3-II 的分子质量较LC3-I 大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE 中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE 偶联的LC3) 快。可以通过Western blot比较组间LC3-II 水平, 也可通过计算LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II 水平, 并推测自噬囊泡数量的多少。LC3 在含SDS 的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot 实验, 并避免反复冻融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例与自噬体的数量呈正相关, 在某种程度上反映了细胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是动态的, 自噬体的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效应部分阻断, 自噬体无法被清除导致的。因此仅评价自噬体数量或LC3-II 的表达均不能代表整个自噬过程。只有客观地分析自噬动态变化才能准确地判断自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的检测成为反映自噬活性更为可靠的指标。
1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 进化上高度保守, 在酵母以及哺乳动物细胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、来源于高尔基体膜的单层囊泡上, 这些Atg9 囊泡在胞浆快速运动, 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳动物细胞mAtg9 与自噬囊泡存在动态相互作用。在形成成熟自噬体后, mAtg9 并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆。有研究表明, mAtg9 在形成双FYVE 结构域蛋白1 (double FYVE-containing protein 1, DFCP1)阳性的自噬体前体中是必需的, 但不依赖于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 样激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在内体和内体样的部位, 推测其在多种细胞器如再循环的内体间活动, 在自噬的起始进程中发挥极为关键的作用。mAtg9 可用来检测自噬的发生。
1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳动物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分选蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高尔基体 (trans-Golgi network, TGN)、内质网和线粒体。Beclin1 与Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶复合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞浆中其他自噬相关蛋白Atg 结合到前自噬体膜上, 在自噬体形成早期发挥重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制剂可干扰自噬体的形成。此外, Bcl-2 与Beclin1 结合也可抑制自噬活性。用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP 的点状聚集或斑块作为自噬标志物。但Beclin1 自身有核定位信号, 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的.干扰, 因此Beclin1-GFP 荧光显微结果显示有核定位倾向, 可能会影响对自噬状态的评判。在Beclin1 依赖的自噬中, PI3K 活性在自噬体形成中至关重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中测定PI3K 活性可用来监测其对自噬的调节影响。
1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬体上, 其羧基端被命名为BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 区域。BATS 区域在Beclin1 招募和自噬活化中意义重大。Atg14 的BATS 区域通过α 螺旋的疏水表面与自噬囊泡膜结合。在应激情况下, BATS 点状聚集或斑块与Atg16 和LC3 以及部分自噬早期标志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用荧光显微镜或投射电镜技术检测自噬水平时可作为自噬标志物。但除了定位于自噬体, Atg14 也定位于自噬溶酶体和内质网上。因此, 用Atg14 作为标志物时最好也结合用其他自噬标志物做鉴定。
1.1.7 损伤调节自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一个具有六个跨膜结构的疏水蛋白。除了定位于顺面高尔基体, DRAM1 也定位于早期和晚期内体和溶酶体, 它与早期核内体相关蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶体相关膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在应激情况下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默会阻断自噬的发生。由于DRAM1分子质量很小, 大约28 kDa, 加之其疏水性强, 蛋白水平检测有一定难度, 可考虑用实时定量PCR 对其mRNA 水平进行检测。
1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 锌指FYVE 结构域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被称为双FYVE 结构域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即为两个锌结合的FYVE 结构域。FYVE 结构域参与膜转运和细胞信号, 促进其与含PI3P 的膜结合。ZFYVE1/DFCP1 与PI3P 结合后, 定位于内质网和高尔基体。饥饿诱导DFCP1 转位至粗面内质网的粗粒上, 显示在欧米茄体 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作为自噬形成初期的标志物。DFCP1的表达可用荧光免疫组化方法观察, 出现DFCP1 阳性的点状分布则意味着自噬囊泡正在开始形成期。
1.2 溶酶体标志物
因为自噬过程最终的完成是在溶酶体中进行的,因此溶酶体标志蛋白在自噬功能研究中就显得极为重要。在酸性水解酶的作用下, 进入溶酶体的自噬体内容物被降解。降解生成的可溶性小分子物质经自噬溶酶体膜渗透入细胞质, 参与细胞的物质代谢活动。目前已识别的25 个溶酶体膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP-1)、LAMP-2 和溶酶体整合膜蛋白 (lysosomal integralmembrane protein, LIMP-2)。可用免疫组化或Western blot 的方法检测溶酶体重要膜蛋白的水平,并与其他自噬相关蛋白结合使用。
1.3 自噬底物
p62 也被称为SQSTM1, 在多种细胞和组织中都有表达, 可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62 可连接LC3 和泛素化的底物, 随后被整合到自噬体中, 并在自噬溶酶体中被降解。当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合, 自噬囊泡中p62 等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解, p62 水平降低; 当自噬被抑制时自噬体积累, p62 水平升高。因此, 可以用Western blot 方法检测p62 的水平, 作为自噬能力变化的指征。
除了与LC3 和泛素化蛋白结合外, p62 可能还参与形成雷帕霉素靶蛋白复合物 (target of rapamycincomplex 1, TORC1)。p62 还与蛋白酶体功能相关。当蛋白酶体功能被抑制时, p62 水平也会增高。此外,p62 也是钙依赖的非溶酶体蛋白酶calpain 1 的底物,因此很难解释它在自噬与死亡检测中的意义。在自噬被激活时, LC3 的上调和p62 的表达下降不一定有明显的关联。尽管p62 可以作为自噬损害或者自噬流改变的辅助标志, 但最好联合其他指标如LC3 进行自噬流的评估。
2 CMA 的标志物
CMA 是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70 (heat shock cognate protein of 70 kDa,HSC70) 识别, 并将其运送到溶酶体膜上, 再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a 结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程。与大自噬和小自噬相比,CMA 的主要特点是细胞质内的蛋白质直接经溶酶体膜蛋白转运入溶酶体腔, 不需形成自噬囊泡。
2.1 HSC70
HSC70 是分子质量为70 kDa 的热休克同源蛋白,它是分子伴侣, 在胞浆识别带有KFERQ 样序列的CMA 底物。HSC70 与定位于溶酶体腔面的Hsp90 相互作用。在HSC70 的帮助下, 底物在穿越溶酶体膜时开始从折叠状态去折叠, 并在LAMP-2a 复合物形成之前完成。将底物转运穿越溶酶体膜还需要定位在溶酶体膜上的HSC70 (lys-HSC70)。HSC70 的稳定性依赖于溶酶体的pH 值。pH 值轻微的上升都会促进HSC70 的降解。
2.2 LAMP-2a
LAMP-2 有3 个亚型, LAMP-2a、LAMP-2b 和LAMP-2c, 借助RNAi 技术显示只有LAMP-2a 才是CMA 途径重要的受体。CMA 的速率直接依赖于溶酶体膜上LAMP-2a 的含量。LAMP-2a 在胞内的水平可由于转录水平改变或降解速率改变而发生变化。抑制LAMP-2a 将引起CMA 底物GAPDH 的聚集; 过表达LAMP-2a, 则引起GAPDH 水平下降。
3 线粒体自噬标志物
线粒体自噬指在ROS、营养缺乏和细胞衰老等内外环境的刺激下, 细胞内的线粒体发生去极化, 而这些被损伤的线粒体将被特异性地包裹进自噬体中并与溶酶体融合, 从而完成损伤线粒体的降解, 维持细胞内环境稳定的过程。细胞主要通过选择性自噬来进行线粒体的更新。损伤的线粒体在发生线粒体自噬之前先发生动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介导的线粒体分裂。线粒体膜电位的下降引起PTEN 诱导假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-inducedputative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接着招募E3 泛素连接酶Parkin 到线粒体。Parkin 促进线粒体膜上蛋白质泛素化, p62 蛋白与线粒体上泛素化蛋白相互作用,借助p62 与LC3 的互作引导线粒体被自噬体包裹。同时, 线粒体上存在自噬受体如BNIP3 (Bcl-2 andadenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/BNIP3L (BNIP3-like) 也可以与LC3 互作使得受损线粒体通过自噬方式被去除。研究中通常用线粒体标志物和自噬标志物LC3共定位来显示线粒体自噬。此外, 还有几个线粒体自噬受体也可以考虑用作线粒体自噬的标志。
3.1 Atg32
酵母中, Atg32 是一个分子质量约59 kDa 的跨膜蛋白, 定位在线粒体外膜上。在氨基端有与Atg8 和Atg11 结合的结构域, 在线粒体自噬的发生中作用巨大。Atg11 是个脚手架蛋白, 在选择性自噬中为Atg蛋白的装配提供平台。羧基端可能发挥调节线粒体自噬的作用。抑制Atg32 表达会减少线粒体自噬的效率,同样地, 过表达Atg32 则增加线粒体自噬的效率。研究认为Atg32 是酵母线粒体自噬发生的限速步骤。进一步的研究发现酵母中Atg32 缺失并不明显影响普遍意义上的自噬, 因此认为Atg32 是引导线粒体自噬专属分子。尽管线粒体自噬是进化上保守的现象,但是在哺乳动物细胞中并未发现Atg32 的同源基因。
3.2 BNIP3 和NIX
BNIP3 和NIX 序列上有56% 的同源度, 且都有BH3 结构域, 并与Bcl-2 作用。NIX 与BNIP3 定位在线粒体和内质网上, 通过影响线粒体呼吸和ROS 水平调节凋亡和程序性坏死。BNIP3 插入线粒体的外层膜,其氨基端在胞浆中, 而羧基端在线粒体内。BNIP3 诱导线粒体嵴消失并促进细胞色素C 释放, 同时, NIX和BNIP3 包含有与LC3 结合的LC3 相互作用区域(LC3-interaction region, LIR), 因而也被称为是线粒体自噬受体。BNIP3 的17 位丝氨酸和24 位丝氨酸的磷酸化会促进其与LC3 结合, 易化线粒体自噬的发生。NIX 与Ras 家族小GTPase—Rheb 互作促进线粒体自噬。此外, NIX 可促进Parkin 定位到受损线粒体上, Parkin 又对线粒体膜上蛋白质进行泛素化, 从而引导p62 与LC3 的互作而发生线粒体自噬。
4 小结
自噬标志物的检测在自噬研究中发挥了巨大的作用, 使得人们可以简便、动态、实时并定量地检测细胞内自噬水平。然而单独检测每一种自噬标志物都有一定的局限性和影响因素, 在研究自噬时必须慎重考虑研究条件, 适当设置阴性与阳性对照, 使用多种自噬抑制剂或者基因沉默等技术, 多方面、多层次进行实验以确认细胞的自噬水平。
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