研究结核分枝杆菌中自噬的作用论文
从酵母菌到人类，自噬是一种广泛存在的生物代谢过程。早期认为，自噬是宿主细胞在饥饿条件下通过降解受损或衰老的细胞器/蛋白质来补充营养物质。除了物质再循环，自噬在各种生理和病理生理过程中也起着关键作用，如胞质成分的清除、细胞生长、衰老和死亡。此外，自噬也参与协调全身的固有免疫、适应性免疫和炎症反应。结核病( tuberculosis，TB) 是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB) 引起的慢性细胞内感染，研究表明自噬参与抗MTB 感染的宿主防御应答。现就自噬在宿主抗MTB 感染免疫应答中的作用进行综述。
1 自噬的细胞和分子水平
自噬是真核生物中高度保守的细胞降解途径，通过消化降解自身胞质成分，实现大分子物质的回收利用。自噬可分为3 类: 大自噬、小自噬以及分子伴侣介导的自噬( chaperonemediatedautophagy，CMA) 。大自噬( 以下称作自噬) 是将胞质蛋白或细胞器包裹形成自噬小体进行降解。自噬可响应于各种胁迫状态，例如饥饿可上调自噬，但营养丰富的条件下自噬也具有本底活性。自噬可以是非选择性( 例如当氨基酸不足时) 或选择性，选择性自噬包括细胞器特异性自噬( 线粒体自噬、过氧化物酶体自噬和内质网自噬) 和异源性自噬( 清除病原体的途径)。一系列体外实验[2]初步阐明了自噬的分子机制，超过30 多种自噬相关基因( autophagy-related genes，ATG) 蛋白产物参与自噬的信号传递与调节: 类线虫51 样蛋白激酶/黏着斑激酶家族相互作用蛋白200 ( Unc-51-like kinase /focaladhesion kinase family interacting protein of 200 kD，ULK/FIP200) /ATG101 /ATG13 蛋白激酶复合物，Vps34 /beclin-1 /Vps15 /ATG14 脂质激酶复合物，这2 种复合物相互作用产生富含磷脂酰肌醇三磷酸( phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3) 的吞噬泡; 2 种泛素样蛋白缀合系统( conjugationsystem) : ATG5 /ATG12 /ATG16 复合物和ATG8 /微管相关蛋白1轻链3( microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，膜结合的ATG8 为自噬体膜特异性表达，常被用作自噬的检测手段。
2 MTB 的生存策略
MTB 是结核病致病病原菌，MTB 的特征是高感染率和低根除率。MTB 通过阻断吞噬体合成和成熟从而使MTB 在感染的巨噬细胞中长期生存。MTB 使用多种策略避免被杀灭:溶解并从吞噬体逃脱，修饰吞噬体阻碍其成熟，甚至在酸性/被降解的吞噬体中长期生存。自噬是宿主防御MTB 的有效途径之一，自噬可直接消灭胞内MTB，从而限制MTB 的生长。细菌感染可诱发宿主细胞内形成双层膜室( 称为自噬体) ，并同溶酶体融合，降解吞噬的病原体。有研究揭示某些细菌能抑制诱导自噬的信号传递，干扰自噬机制来逃逸或阻止溶酶体和自噬体的融合，利用宿主蛋白掩饰自身以避免被识别，甚至有些细菌主动利用自噬组件来促进自身在细胞内生存生长。MTB 可通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target ofrapamycin，mTOR) 依赖的Wnt /SHH( Hedgehog 的同源基因，Sonic Hedgehog) 信号通路抑制γ 干扰素( interferon γ，IFN-γ)介导的自噬。
3 自噬抗结核感染中的作用
自噬作为固有免疫和适应性免疫通路的下游效应之一，在抗MTB 感染的免疫应答过程中发挥着不可或缺的作用: 传递Toll 样受体( Toll-like receptors，TLR) 等固有免疫受体信号，协同细胞因子发挥防御作用，调节免疫相关GTP 酶( immunityrelated GTPase，IRG) 途径，增强抗原提呈和影响T 细胞的稳__态等。多条宿主防御MTB 的免疫通路激活自噬，现初步明确抗MTB 自噬的亚细胞定位和诱导机制。
3. 1 自噬是病原体相关分子模式( pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP) 调控的效应器模式识别受体( pattern recognition receptors，PRR) 主要表达于固有免疫细胞胞膜表面或细胞质中，一种PRR 可识别一种或多种PAMP，其中Toll 样受体是宿主识别病原微生物( 包括MTB) 激活固有免疫防御机制的关键启动点。目前为止，共发现10 个人类TLR 和12 个小鼠TLR。参与识别MTBPAMP 的TLR 主要有: TLR2 ( 与TLR1 /TLR6 形成异源二聚体) 、TLR4 以及TLR9( 识别MTB 的DNA) 。这些TLR 同样参与到抗MTB 的自噬信号通路中，TLR 信号调节固有免疫防御的启动和发展，通过与细胞自噬通路合作消除胞内MTB。抗菌肽是极为重要的针对MTB 的免疫防御物质。MTB表面的脂蛋白可以刺激人类巨噬细胞TLR2 /TLR1，产生抗菌肽，增强维生素D 受体信号转导和提高细胞自噬活性，促进自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体杀灭细菌。TLR 信号介导的自噬信号转导途径，大致可分为髓样分化因子88( myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88) 非依赖性和MyD88 依赖性。脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 是TLR4 的配体，刺激巨噬细胞可增强MTB 吞噬体与自噬体的共定位，LPS 诱导的自噬是MyD88 非依赖性，依赖于TLR4 /含有TIR 结构域的诱导干扰素β 的接头蛋白/受体相互作用蛋白1 /p38 丝裂原活化蛋白激酶( TLR4 /TIR domain-containingadaptor protein / receptor interacting protein 1 /p38 mitogenactivatedprotein kinases，TLR4 /TRIF/RIP1 /p38MAPK) 信号途径，同自噬引起的细胞凋亡通路不同，这条通路并不影响细胞生存。刺激TLR7 可通过MyD88 依赖性途径诱导自噬杀灭胞内MTB，beclin 1 ( 酵母ATG6 同系物) 和Atg5 参与其中。然而，TLR7 并不识别MTB 病原体相关分子模式，但仍能加强宿主细胞对胞内MTB 的.清除作用。其他不参与到MTB 的识别作用的PRR 介导自噬的研究也证实了这点。因此即使靶病原体组分不是特定TLR 的配体，但增强其介导的自噬活性仍然能加强对病原体的清除，众多TLR 和其配体激活的自噬在消除胞内MTB 中发挥重要作用。
3. 2 自噬协同细胞因子发挥炎症作用细胞因子在宿主防御MTB 中起到重要作用: Th1 细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factor α，TNF-α) 和白细胞介素12( interleukin 12，IL-12) 在抵御MTB 中发挥着作用，Th2 细胞因子IL-4 的水平，与疾病严重程度相关。一系列细胞因子和自噬相关的研究表明，Th1 细胞因子活化自噬，而Th2 细胞因子抑制自噬。IFN-γ 对宿主抗MTB 至关重要，在小鼠中，IFN-γ 介导诱导型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，NOS2) 通过生产NO 抑制MTB 的生存，同时激活自噬来克服MTB 引起的吞噬体成熟障碍。对TNF-α 诱导的自噬抗MTB 的机制研究则更为深入，TNF-α 通过阻断蛋白激酶B ( proteinkinase B，Akt) 导致mTOR 的失活从而促进细胞自噬水平，AGT4 和活性氧( reactive oxygen species，ROS) 参与其中。IL-4 和IL-13 是两种典型的Th2 细胞因子，可以抑制NO 的产生，衰减巨噬细胞对胞内MTB 的杀灭能力。体外实验中，IL-4 和IL-13 拮抗自噬以及其对MTB 的杀灭作用。IL-4和IL-13 抑制饥饿诱导的自噬是通过依赖Akt 信号通路，然而Akt 信号并不参与IFN-γ 诱导的自噬。抗自噬效应蛋白Bcl-2和Bcl-XL 参与IL-4 和IL-13 介导的抑制自噬作用，机制是Bcl-2 和Bcl-XL 可以同beclin 1 直接结合，从而阻断自噬的进程。总的来说Akt 信号参与到抑制饥饿诱导的自噬，而STAT6 信号途径参与到抑制通路IFN-γ 诱导的自噬。IL-10和IL-6 也被发现能够抑制自噬，在MTB 感染的THP-1 细胞中，IL-6 通过降低ATG12 /ATG5 复合物的表达，阻碍自噬体的合成而发挥抑制效应。MTB 可以上调IL-6 的生产，抑制自噬，以维持自身的生存，mTOR、p38MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminal kinase，JNK) 信号通路参与其中。IL-10 抑制雷帕霉素诱导的自噬作用依赖Akt 和信号转导子和转录激活子3/6( signal transducer and activator of transcription 3/6，STAT3/6) 途径，而拮抗饥饿诱导的自噬是依赖于1 型磷脂酰肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /Akt 信号，小鼠巨噬细胞中，也观察到IL-10 抑制LPS 诱导的自噬作用。阻断自噬将抑制TNF-α 的分泌，增强促炎分子( 如IL-1β 等)的产生，激活自噬能够促进TNF-α 诱导的核因子κB( nuclear factor-Kappa B，NF-κB) 活化和细胞间黏附分子1( intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1) 的表达，这表明细胞因子同自噬条件作用或许是相互的。
3. 3 IRG 参与自噬的抗菌作用在对IFN-γ 诱导自噬抗MTB 的精确机制研究中，发现IRG 参与其中。在小鼠研究中证实IFN-γ 的刺激使包含MTB的吞噬体能够募集免疫相关GTP 酶M1 ( immune-relatedGTPase M1，IRGM1)，Irgm1 是小鼠IRG 家族的一个成员。Irgm1 对吞噬体的作用机制仍然是模糊的，甚至Irgm1 对自噬的影响可能是双面的，一方面同IFN-γ 协同作用，以促进抗菌响应，另一方面Irgm1也负调节IFN-γ 介导的自噬，限制免疫细胞的自噬效应。人类基因组中有3 种IRG 旁系同源物，即IRGC、IRGQ和IRGM，但是只有IRGM 是有功能的。该IRGM 基因位于染色体5q33. 1，且有5 个外显子。第一外显子较长编码181 个氨基酸; 4 个较短的外显子从所述第一外显子向下游延伸超过50 000 bp 。多项分子流行病学研究表明IRGM基因的启动子区域的变化，显示出与MTB 感染的风险增加有关。结核病易感性同IRGM 多态性有关，并与多种参与调节自噬过程的其他基因关联。然而，包括宿主的种族、MTB 的种属和地理环境等多种因素均可影响MTB 敏感性。因此需要更多的研究( 包括体内模型) ，才能正确评估自噬相关基因多态性与结核病易感性之间的关系。
3. 4 自噬在抗原提程和T 细胞稳态中的作用T 细胞通过监测由抗原提呈细胞提呈的抗原肽来调节适应性免疫应答作用。主要组织相容复合体( major histocompatibilitycomplex，MHC) Ⅱ类分子提呈的抗原由CD4 + T 细胞识别。自噬能间接或直接增强MHCⅡ类分子对抗原的呈递作用，在巨噬细胞和树突状细胞中TLR7 和TLR9 等有效的上调由卡介苗抑制的MHCⅡ表达，自噬可以协同TLR 免疫效应增强抗原特异性CD4 + T 细胞的活化。此外，在感染了MTB 的小鼠巨噬细胞和CD11 + 树突状细胞表面，用雷帕霉素上调的自噬能够直接增加MTB 分泌抗原Ag85B 抗原递呈。自噬除了通过影响抗原呈递调控T 细胞应答外，能直接作用T 细胞，包括调节T 细胞内环境稳定、活化和死亡。在胸腺T 细胞中，从双阴性到单阳性细胞发展的各个阶段，均检测到自噬活性。自噬对胸腺祖细胞的生存是必要的，Atg5缺陷的人重组激活基因2( recombinant human activated gene 2，RAG2) 和beclin1 基因缺陷的RAG1 - / - 嵌合体存在大大降低了胸腺细胞的总数。外周T 细胞中也显示出自噬的本底水平，T 细胞受体( T cell receptor，TCR) 配体的激活可以上调这种水平。在激活的Jurkat T 细胞中，NF-κB 介导的beclin1基因表达上调，支持了TCR 配体激活的自噬可以增加beclin1的表达。磷脂酰肌醇3 激酶催化亚基3 型( phosphatidylinositol3-kinase，catalytic subunit type 3，Vps34 ) /beclin1 复合物在T 细胞调控自噬的作用是矛盾的结果。在一项研究中，Vps34 缺陷的T 细胞保有自噬活性，但表现出IL-7 受体的缺失，从而降低细胞的存活。然而在不同的基因敲除模型，显示Vps34 对激活T 细胞中的自噬是必须的。因此T 细胞中自噬的活化可能存在2 种途径即Vps34 /beclin1 依赖的经典途径和非依赖Vps34 /beclin1 途径。
4 自噬相关的抗MTB 治疗及展望
自噬与MTB 感染有着复杂的相互作用，深入的体内外研究为将抗MTB 药物带来新的见解。自噬的治疗意义为临床研究提供新的策略: 完善抗结核化疗传统方案，老药新用，将免疫治疗与自噬相结合等。例如，常用的抗结核药物异烟肼和吡嗪酰胺能够促进自噬的激活。雷帕霉素( mTOR 抑制剂) 能够引起mTOR 信号介导的自噬，在巨噬细胞的研究中表明，高剂量雷帕霉素能够有效杀灭分枝杆菌，然而低剂量的mTOR 抑制剂效果不明显。他汀类药物是常用的降胆固醇药物，它们也可以影响免疫应答。他汀类药物治疗通过促进自噬和吞噬体成熟从而杀灭人类和小鼠巨噬细胞中的结核杆菌。雷帕霉素、他汀类药物或维生素D等药物可能会通过诱导自噬提高MTB 的治疗但长期或过量的自噬能增加细胞死亡，通过激活自噬来改善结核病治疗的最佳方式需要进一步研究。DNA 疫苗是很有前途的新一代疫苗，可以通过DNA 编码目的抗原引发特异性免疫应答。抗MTB Ag85B DNA 疫苗的研究中，与细胞自噬相结合的DNA疫苗疗法能显著增强Th1 型细胞因子( IFN-γ 和IL-2) 表达和CD4 + T 细胞免疫效应，利用自噬途径或许代表了抗MTB疫苗接种一个新兴的方向。研究MTB 免疫机制和ATG 蛋白质之间的相互作用一直是近年来研究的主要焦点，大量的研究将使人们更好地理解细菌逃逸自噬的机制，并将其用于治疗MTB 感染的未来药物设计中。
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