深究RDP多肽修饰的姜黄素隐形脂质的作用论文

时间:2021-04-02 18:20:47 论文 我要投稿
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深究RDP多肽修饰的姜黄素隐形脂质的作用论文

  治疗脑内疾病的必要途径需将药物靶向性输送入脑内。以脑靶向性的蛋白或多肽作为载体,可能会实现药物的脑靶向转运。我们实验室以往的研究表明,狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide),可携带核酸、蛋白等生物大分子入脑。脂质体是一种安全有效的药物递送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂质体内核中,在体内安全释出以发挥作用。此外,脂质体较易修饰,从而可使其具有靶向性和高效性。本研究将在脂质体表面的PEG链端连接RDP多肽,以具有抗肿瘤效果的天然植物提取物姜黄素为模型药物,研究该RDP修饰脂质体的脑靶向作用,从而可能为向脑内送脂溶性化合物以治疗脑部疾病,提供一种崭新的途径和方法。

深究RDP多肽修饰的姜黄素隐形脂质的作用论文

  1 材料与方法

  1.1 试剂

  姜黄素,纯度>98%,购自美国Sigma公司;大豆卵磷脂、胆固醇,纯度>95%,均购自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000),购自美国Nanocs公司;Cys-RDP,纯度>95%,购自上海吉尔公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均为色谱纯。

  1.2 仪器

  高效液相色谱仪(包含SPD-M20A检测器和LC-20AD泵),购自日本岛津公司;激光粒度及zeta电位分析仪(NanoZS),购自英国马尔文公司;生物质谱仪autoflexspeedMALDI-TOF/TOF,购自德国BrukerDaltonic公司;AB135-S电子分析天平,购自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮气吹干仪,购自上海八方世纪科技有限公司;XHF-D高速分散器,购自宁波新芝生物科技有限公司。

  1.3 细胞株及培养体系

  人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG(实验室冻存),采用含10%胎牛血清的DMEM-H培养基培养,置于37℃、5%CO2、饱和湿度下的培养箱内。隔天换液,待细胞密度长至80% ~90%时,按照1∶3的比例传代。传代时,加入消化液一定时间后去除,用培养基吹打成单个细胞悬液,取生长良好、活性大于98%的细胞进行后续实验。

  1.4 实验动物

  昆明小鼠80只,♂各半,体质量(20±2)g,购自于重庆滕鑫生物技术有限公司。小鼠饲养于西南大学药学院SPF小鼠饲养室,恒温、恒湿,自由进食、进水。

  1.5 脂质体的制备和表征

  1.5.1 导向化合物的合成

  按照摩尔比2∶1的比例精密称取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中,然后加入20μL的N-甲基吗啉,置于4mL离心管中,在搅拌器中避光搅拌48h。取出反应液,置于透析袋(MW 3500)中,放入2L去离子水中透析48h后(每6h换水1次),冷冻干燥,-20℃保存。

  1.5.2 脂质体的制备

  采用薄膜分散法分别制备姜黄素脂质体(CUR-L)和RDP修饰的姜黄素隐形脂质体(RDP-CUR-L)。按照处方量(Tab1)精密称取各种脂材于10mL茄形瓶中,加入氯仿3mL溶解,37℃减压旋转蒸发10min,使其成均匀的薄膜。然后加入1mL去离子水,37℃于水浴摇床中水化1h,形成悬浮液,间歇超声90s,得到澄清透明呈淡黄色乳光的`脂质体溶液,并分别过100nm的膜使粒径分布均匀,4℃冰箱内保存。

  1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例筛选

  按上述脂质体制备方法制备一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含药靶向脂质体(DSPE-PEG-RDP分别为总摩尔量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L对U87MG细胞抑制率的影响。取对数生长期状态良好的细胞,用0.25%胰酶消化液消化后,调整细胞浓度为5×107·L-1,以每孔500μL(5000个/孔)接种于96孔板,培养24h贴壁后加入不同浓度的CUR-L和RDP-CUR-L,浓度依次为150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1,孵育48h后,弃去培养基,每孔加入浓度为5g·L-1的MTT(20μL),37℃培养4h,弃去培养液,每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色甲#颗粒,用酶标仪在波长为490nm下测定光吸收值(OD)。每组实验重复3次,每个样品做3个平行样。全部实验均设DMSO对照组。

  1.5.4 脂质体粒径、电位、分散度测定

  用激光粒度及zeta电位分析仪分别测定CUR-L和RDP-CUR-L的粒径、Zeta电位、分散度(PDI)。1.5.5 脂质体包封率测定 采用透析破乳法,取用均质机处理过的CUR-L和RDP-CUR-L,每组实验分成两份(每份400μL):一份用透析液透析6h后,收集脂质体部分,以10%的TritonX-100破乳,经HPLC测定包裹在脂质体内的药物浓度C;另一份直接破乳,经HPLC测定姜黄素得到C0,按照公式计算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

  1.5.6 脂质体稳定性考察

  取制得的CUR-L和RDP-CUR-L,分成两个实验组,每组平行3次,分别于3、7、15、30、45、60d后肉眼观察脂质体溶液变化,HPLC测包封率。

  1.5.7 体外释放度测定

  采用动态透析法(dynam-icdialysis),按中国药典2010版附录XC第三法(小杯法)测定释放度。精密量取制剂CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL,经释放介质稀释至3mL,装于透析袋内(截留分子质量为8000u),两端扎牢,放入150mL释放介质中,释放介质为含有0.2%十二烷基硫酸钠的人工胃液,37℃ 下姜黄素在此释放介质中的溶解度为80mg·L-1,满足漏槽条件。37℃恒温水浴搅拌(转速为100r· min-1)。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各个时间点取样0.3mL,并及时补充等温的相同体积空白介质。微孔滤膜过滤,按照HPLC方法检测姜黄素含量,并计算累积释药百分率(%)。

  1.6 姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布

  1.6.1 色谱条件

  C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,大连依利特分析仪器公司);流动相:乙腈∶4%冰醋酸(48∶52),流速:1mL·min-1,检测波长:430nm,柱温:25℃。

  1.6.2 样品预处理

  将姜黄素溶解于1%羧甲基纤维素钠中,配制成浓度为1g·L-1的CUR混悬液,制得的CUR-L和RDP-CUR-L浓度均为1g·L-1,CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黄素30mg·kg-1的剂量于小鼠尾静脉注射给药。取昆明小鼠,禁食12h,尾静脉分别注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L,于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各个时间点分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑(每个时间点3只),用生理盐水清洗后用滤纸吸干,剪碎,精密称重,加入1mL生理盐水,用组织匀浆器匀浆,加入1mL乙酸乙酯,涡旋3min,3000r·min-1离心10min,精密吸取上清液,再加入相同体积的乙酸乙酯,萃取2次,合并上清液,氮气吹干,加入10倍体积的流动相,超声、涡旋使其充分溶解,过膜后进样。

  1.6.3 方法学考察

  专属性:取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各空白组织匀浆液0.3mL,样品处理后采用HPLC法分别进样测定空白样品、空白样品加内标及小鼠尾静脉注射给药后的样品。标准曲线:取小鼠空白组织匀浆液,精密加入姜黄素标准溶液,配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列浓度的样品溶液,样品处理后,以姜黄素的峰面积与样品中姜黄素的浓度(C)进行线性回归。回收率与精密度:配制低、中、高浓度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黄素质控样品,各5份,按“样品处理”项下方法处理,进样测定。以姜黄素的峰面积代入标准曲线方程,计算出姜黄素的浓度,与实际加入量比较,计算方法回收率,用以表示准确度;以相应低、中、高浓度的姜黄素对照品溶液直接进样,以质控样品中姜黄素峰面积与对照品溶液中姜黄素峰面积比较,计算提取回收率;1d内进样测定5次,连续测定5d,计算日内RSD和日间RSD。

  2 结果

  2.1 脂质体的制备和表征

  2.1.1 导向化合物的合成

  生物质谱分析反应产物DSPE-PEG-RDP的结果如Fig1所示。RDP相对分子质量为3671,DSPE-PEG-NHS分子质量为3094,得到的产物DSPE-PEG-RDP相对分子质量约为6800,说明导向化合物制备成功。

  2.1.2 脂质体的粒径、zeta电位、分散度及包封率

  CUR-L和RDP-CUR-L粒径、zeta电位、分散度和包封率如Tab2所示。结果表明,CUR-L粒径为(81.20±5.13)nm,而RDP-CUR-L经RDP修饰过后粒径为(98.56±6.97)nm,分散性良好,包封率均大于85%,制备重现性较好。

  2.1.3 脂质体稳定性

  CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后,溶液依旧澄清透明,呈淡黄色乳光,与新制备时相比无明显变化。不同时间点测其包封率,可以看出RDP修饰对姜黄素脂质体包封率影响不大,60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右,可见稳定性良好。

  2.1.4 导向化合物DSPE-PEG-RDP比例筛选

  ,当加入的DSPE-PEG-RDP为总摩尔量的1.0%时,RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用明显优于CUR-L(P<0.01)。随着DSPE-PEG-RDP比例的增加,U87细胞的存活率逐渐降低,这表明在脂质体的PEG链端连接RDP能增强对U87细胞的抑制作用,当加入比例达5.0% 时,RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用最强,与0.5%时相比差异有显著性(P<0.05)。当比例超过1%时,RDP-CUR-L对U87细胞的抑制变化不明显,表明继续增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L对U87细胞的抑制率。密度筛选实验结果表明,DSPE-PEG-RDP的加入比例能影响脂质体的靶向效率。出于实验效果和经济性考虑,选取加入比例为1.0%进行以下的实验。

  2.1.5 体外药物释放

  由于姜黄素在水中几乎不溶解,采用加入2% 十二烷基硫酸钠(SDS)的人工胃液为释放介质,考察姜黄素制剂的释药情况。CUR-L在前6h内大量释放,累计释放量接近60%,而后进入慢速释放期,12h释放量约为80%,而RDP-CUR-L释放在该释放介质中较慢,6h后释放约45%,24h后累积释放量不到80%,表明RDP-CUR-L有着更好的缓释作用。

  2.2 姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布

  2.2.1 方法学考察

  在上述色谱条件下,方法专属性良好,峰形良好,保留时间约为14min,组织中的内源性物质不干扰样品测定。样品中的姜黄素在1.5625~50mg·L-1线性关系良好(r=0.9994)。方法回收率为(95.87±4.98)%,高、中、低3个浓度的提取回收率分别为(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5),日内精密度和日间精密度小于15%,均符合生物样品分析方法的要求。

  2.2.2 体内分布和脑靶向作用考察

  小鼠尾静脉注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同时间各组织中的姜黄素。注射CUR后,随着时间的推移,姜黄素在各个脏器中含量逐渐减少,姜黄素大量分布在肺、肝、肾等脏器中,心、脾中也有少量分布,然而由于血脑屏障的作用,脑部并未检测到姜黄素。注射CUR-L后,由于易被网状内皮系统吞噬,姜黄素主要分布在肝、肾、肺中,在脑、脾中少量分布,而在心脏中没有检测到姜黄素。RDP-CUR-L经尾静脉给药后大致分布与CUR-L类似,但在脑中检测到大量的姜黄素,并且在小鼠体内的滞留时间明显延长,24h仍然能在脑中检测到姜黄素。

  3 讨论

  脂质体作为药物载体具有使药物被动靶向网状内皮系统、延长药物作用时间、减少药物不良反应、提高疗效等优点。表面经柔性高分子PEG修饰,增大了脂质体的空间位阻,同时提高了膜表面亲水性,使得其不易被网状内皮系统(reticularepithelialsystem,RES)摄取,因而PEG化的脂质体较普通脂质体更长效。

  虽然脂质体经PEG修饰后能够延长在体内的循环时间,增加在肿瘤组织中的聚集,但是由于“PEGdilemma”现象的存在,阻碍了肿瘤细胞对脂质体的内吞,故在脂质体的PEG链端连接靶向配体如叶酸、转铁蛋白、抗-EGFR抗体等,使得靶向配体与肿瘤细胞过度表达的受体特异性结合,通过“配体-受体”特异性识别与结合作用,能够促进细胞对载体的吞,增加药物的抗肿瘤效果,并且可以定向地将药物运送到靶部位,实现对肿瘤组织的“主动靶向”。脂质体或者纳米粒子表面修饰特异性配体或受体,主动靶向特定肿瘤组织的文献已有大量报道。一些常见的细胞穿膜肽,如TAT、多聚Arg、转运素,已被证实能够在体外将核酸、蛋白等小分子物质转导入培养的细胞。Khafagy等研究发现,L-型穿膜肽penetratin可以明显增加胰岛素的渗透性,从而使其穿过鼻膜,并不会对鼻吸收黏膜上的细胞完整性造成明显的破坏。据文献报道,另一个从狂犬病毒糖蛋白衍生出的一个小肽与多聚Arg连接后,能够输送siRNA靶向性地进入中枢神经系统,导致相关基因沉默。KaiPharmaceutical公司应用Tat引导蛋白激酶C抑制剂的蛋白调节子,用于脑缺血和急性心肌缺血的治疗,并且已于2007年进入了Ⅱ期临床试验。

  然而,用细胞穿膜肽引导脂质体等纳米载体进入特定的组织,特别是脑组织的文献却并不多见。普通CPPs虽然能介导各类分子入胞,但是其缺乏细胞特异性,而本实验中所用的细胞穿膜肽RDP是一种来源于狂犬病毒糖蛋白RVG,并经过结构改造而得到的一种能靶向中枢神经系统、具有很强嗜神经性的衍生肽,同时具有良好的穿膜特性和对神经细胞的高度选择性。实验室前期研究已表明RDP能够引导核酸、多肽等小分子物质入脑,而本实验中通过体内分布实验证明了RDP连接的姜黄素脂质体在体内运输过程中没有发生断裂,确实能够携带包裹了姜黄素的脂质体入脑,不仅仅拥有理论意义,也具有潜在的应用价值。这为脑部疾病的治疗提供了新的思路。