斑马鱼早期胚胎背腹发育中ripply1的作用论文
胚轴（ embryonic axes） 形成是多细胞生物躯体模式（ body plan） 建立的一个重要过程，主要包括前- 后轴 （ anterior-posterior axis ） 、背 - 腹轴 （ dorsal-ventral axis） 和左 - 右轴（ left-right axis） .对两栖动物胚胎的研究发现背 - 腹轴早在受精后即可观察到，如爪蛙胚胎皮层转动形成的灰色新月区在后期发育成背部。德国发育生物学家 Hans Spemann 和他的学生 Hilde Mangold 将原肠早期蝾螈胚胎的背部组织移植到另一种蝾螈胚胎的腹部，得到了形成双体轴的胚胎，次级体轴的脊索来自于供体胚胎，而神经管和体节多数来自于受体，这说明该背部组织能诱导周围受体胚胎的细胞形成神经管，首次提出了胚胎诱导的概念并称该背部组织为组织者（ or-ganizer） .
ripply 家族蛋白在 2005 年被发现并揭示了其部分功能[1],研究发现 ripply1 和 ripply2 特异表达于体节，其中 Ripply1 蛋白与转录辅抑制因子 Groucho 结合，能够终止分节基因的表达，维持体节的前后极性。之后对 ripply1 的研究都集中在其在体节时期对体节发生的作用，而其在早期胚胎模式发生的作用却研究甚少。但最近在爪蛙中的研究发现 ripply家族蛋白能通过其 WRPW 区域结合多梳蛋白（ Polycomb group proteins） 起转录去抑制的作用，并且在背 - 腹轴形成过程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎发育早期的.表达图式和调节方式还不清楚。并且，ripply3 是人的唐氏综合征关键区域基因 6（ Down syndrome critical region gene 6,dscr6） 的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用机制能为人类遗传疾病的致病机理提供信息。我们通过原位杂交技术发现 ripply1 在斑马鱼早期胚胎中特异表达在背部，因此推测其可能参与背腹发生。故而通过过 表 达 ripply1,并 调 取1. 2 kb的启动子片段，初步研究其在胚胎早期背腹发生的作用。
1 材料和方法
1. 1 材料
AB 品系的斑马鱼养殖在 28. 5℃ 的循环水系统中，如早期工作所描述[4].
1. 2 方法
1. 2. 1 获取 ripply1 cDNA取斑马鱼胚盾（ shield） 时期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎总 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒反转录，详细步骤参见使用说明书。
1. 2. 2 斑马鱼 ripply1 整胚原位杂交调取 ripply1 全长 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶扩增后将其连入 pGEM-T 载体中。根据测序方向合成地高辛标记的反义 RNA 作为探针使用。其他探针如goosecoid （ gsc） 、chordin （ chd） 、floating head （ flh） 、even-skipped-like 1 （ eve1） 、T-box6 （ tbx6） 、wnt8a 详见作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反义 RNA 用原位杂交液 hyb+（ 50%甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20,0. 5 mg/mL酵母 RNA,0. 05 mg/mL 肝素） 稀释至 1 ng/μL.收集不同时期的斑马鱼胚胎，固定于 4% 多聚甲醛中过夜。过渡到含 0. 1% Tween-20 的 PBST 中，并在PBST 中将胚胎膜剥去，用 PBST 洗过后在原位杂交液 hyb-（ 50% 甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20） 中65℃ 孵育 10 min,之后在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探针 60℃ 孵育过夜。第 2 天吸出探针以重复使用。
胚胎用洗液 I（ 50% 甲酰胺，2 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重复 1 次； 用洗液 II （ 5% 甲酰胺，0. 2 × SSC,0. 1%Tween-20） 洗15 min（ 60℃） ,重复 1 次； 用洗液 III （ 0. 5% 甲酰胺，0. 02 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重复 1 次。然后用 MABT 在室温下洗3 次，用封闭液封闭4 h.偶联碱性磷酸酶的地高辛抗体 1∶ 2500 稀释于封闭液中，4℃ 孵育过夜。第 3 天吸出抗体以重复使用，用MABT 在室温下洗 30 min,重复 1 次； 用 PBST 在室温下洗 30 min,重复 1 次； 在平衡缓冲液（ 0. 1 mol/LNaCl,0. 1 mol / L Tris-HCl pH 9. 5,0. 05 mol / L MgCl2,0. 1% Tween-20） 中平衡 10 min,加显色液（ 5 mL 平衡缓冲液中加100 μL 60 mg/mL 左旋咪唑，100 μLNBT / BCIP） ,室温避光，待信号足够强加多聚甲醛终止反应，在70%酒精中脱去浮色，拍照观察。
1. 2. 3 显微注射 ripply1 mRNA显微注射方法详见早期工作[5].ripply1 mRNA注射剂量为每个胚胎 200 pg.
1. 2. 4 ripply1 启动子序列及转基因鱼的获得从基因组中调取 ripply1 基因组上游约 1. 2 kb的片段，引物如下： promoter-F: 5'-ATTCTCGAGG-GATCCAAAACAGCTTAT-3',promoter-R: 5 '-ATTA-GATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3'.并且在上下游引物中分别引入 Xho I 和 Bgl II 酶切位点，双酶后切连入 pT2A200R150G 载体。
单独注射该质粒观察胚胎是否有荧光。有荧光后将该质粒和转座酶 mRNA 共注射，剂量均为 50pg,待该批注射的斑马鱼 F0 代性成熟后外交，筛选后代胚胎有特异荧光的 F1 代。
2 结果
2. 1 整胚原位杂交揭示 ripply1 在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式为了明确 ripply1 是否参与早期背 - 腹轴的形成，我们首先利用整胚原位杂交检测该基因的时空表达图式。结果显示 ripply1 母源表达，但表达水平低。在原肠作用早期即胚环期表达增强且集中在预定背部的胚盾位置，在胚盾期 ripply1 在背部的表达继续增强，并且向侧部延伸。在原肠期，随着细胞运动的进行，ripply1 主要表达在前脊索板中胚层和后部将要形成的体节中，但在脊索中胚层中没有表达（ 图 1） .这个表达图式暗示 ripply1 基因可能在背- 腹轴和前 - 后轴形成过程中起调节作用。
2. 2 高表达 ripply1 导致胚胎背部化
我们下一步对 ripply1 在背 - 腹轴形成中的作用进行了功能检测。在胚胎 1 细胞期通过注射 rip-ply1 mRNA 进行高表达，收集胚盾时期的胚胎进行原位杂交。分别检测背部标记基因 gsc、chd、flh 和腹部标记基因 eve1、tbx6、wnt8a 的表达。我们发现几乎所有 ripply1 注射的胚胎背部标记基因 gsc、chd、flh 表达不但在背部增强并且明显向腹侧扩增。
相反，腹部标记基因 eve1、tbx6、wnt8a 表达明显减弱（ 图 2） .这个结果说明高表达 Ripply1 改变了背腹细胞的命运，使背部区域扩大。显示 ripply1 能调节斑马鱼背部的发育。在 10 hpf（ 胚芽期） 时观察胚胎的表型，发现原本呈球形的胚胎前后伸长，呈现明显的椭球形，这是典型的背部化表型（ 图 3A,B） .24 hpf 后观察胚胎，大多数胚胎（ 82/99） 表现出背部化，其中 36 枚胚胎头部增大，尾部缺失（ 图 3C,D） ,而 46 枚胚胎头部明显增大，体轴变短，尾部变短，无腹部尾鳍（ 图 3E） ,一小部分胚胎（ 6/99） 甚至呈现双体轴（ 结果未显示） .这些表型进一步说明 ripply1 通过抑制胚胎后部发育来促进前部的发育。
2. 3 ripply1 启动子及转基因斑马鱼
为了研究 ripply1 时空表达的调节机制，我们开展了对其启动子的研究。获得 ripply1 转录起始位点上游 1. 2kb 的片段后，将其后加 EGFP,然后克隆到 pT2A200R150G 转基因载体上（ 图4A,B） .质粒注射后发现在胚盾期在胚盾处有特异的荧光表达（ 图 4C,D） ,体节期在体节处有特异的表达（ 结果未显示） ,说明该 1. 2 kb 的片段能够调控 ripply1 在斑马鱼胚胎中时空特异的表达。与转座酶共注获得转基因鱼 ripply1: EGFP 的 F0 代，发现其子代在 1细胞期即有荧光，直到胚盾期仍是泛表达（ 图 5A-C‘） ,可能是由于 EGFP 比较稳定，而母源的 ripply1比较容易降解。在体节期该荧光则特异定位在躯干（ 图 5D,D’） .在 24 hpf,EGFP 信号主要集中在体节中（ 图 5E） ,而在成鱼中，EGFP 信号主要集中在整个躯干部分（ 图 5F-G‘） .
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